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2018年1月19日 星期五

丁酉(鸡)年十二月初三

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  对核酸的组成单元──核苷酸排列顺序的测定。核酸的顺序分析有助于揭示核酸结构与功能的关系。
  脱氧核糖核酸 (DNA)的顺序分析 1975年以前科学家们曾从不同的角度探索测定DNA顺序的方法。如将DNA转录成RNA,测定了RNA顺序以后,应用互补原理推测DNA的顺序;或用一种核糖核苷酸取代DNA中的脱氧核糖核苷酸,而后用碱或核糖核酸酶 (RNase)降解核糖核苷酸键,以求出核苷酸的排列次序;又如将寡核苷酸片段的一端用放射性同位素标记,用外切酶逐个切去非标记端的核苷酸,用双向电泳同系层析法将所得的酶解产物按不同电荷和链长分开以完成核酸的顺序分析等;但这些测定方法都很费时,不够精确,不能普遍应用,而且只能测定一些小的 DNA片段。1975年英国F.桑格建立了“加减法”推动了 DNA顺序的测定。桑格提出以测定已知末端核苷酸性质的 DNA片段的分子长度来推测核苷酸的顺序。这样,过去用于测定生物高分子顺序的基本方法──小片段重叠法的框框被突破了。此后发展起来的各种 DNA、RNA顺序测定的新方法都是以这个原理为基础的。
  目前被使用得最多的快速可靠的测定 DNA顺序的方法是:①F.桑格的双脱氧法;②A.M.马克萨姆和W.吉尔伯特的化学法。
  双脱氧法 基本原理是利用 DNA聚合酶的聚合反应。在反应混合物中有模板、引物、酶、四种脱氧核苷三磷酸(如 dATP)和一定比例的2′,3′双脱氧核苷三磷酸(如 ddATP)(图1)。核酸的顺序分析因此,在合成过程中,遇到应该参入dATP的位置就有二种可能的情况发生。若dATP参入,则链可以继续延伸,若ddATP参入,合成反应就不能进行了,因为ddATP的3′位置没有羟基。因此,可以得到一系列不同长度的,以ddA为结尾的片段。同理,也可以得到以G、T或C为结尾的片段。经过尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分离以后,就可以直接“读出”核苷酸顺序了(图2)。核酸的顺序分析这是一个既方便又精确的方法。双脱氧法需要单链 DNA作为模板。70年代后期发展起来的把 DNA重组到单链噬菌体中,经增殖之后,可以获得大量的单链DNA。由于这种方法制备的单链DNA是插入到病毒载体的固定位置上,因此靠近插入DNA的末端具有相同的顺序,这就可以利用同一种引物来对付任何待测定的外源 DNA。因此大大推动了双脱氧法的发展。后来又用此系统提出了 DNA顺序测定的非随机法。其基本原理是利用病毒载体复制点和 DNA水解酶将被测定的DNA长链的一端固定,而将靠近引物区的一端逐渐缩短,形成一组长短不同的亚克隆。从中分离出适当的亚克隆后,就可以定向测定整个DNA长链的顺序了。克服了随机法中固有的无用重复测定和寻找特定 DNA片段的困难。载体病毒分子越小,能插入的外源DNA链越长,DNA片段分级率越高、非随机法的效率就越高。不少科学家们正在朝这个方向努力。
  化学法 马克萨姆和吉尔伯特利用能专一地修饰碱基的化学试剂,使相应的糖苷键变得不稳定,这样也得到以特定碱基决定长度的4组DNA片段。硫酸二甲酯在二甲胂酸存在时可以使鸟嘌呤甲基化。甲基化鸟嘌呤的糖苷键是不稳定的,在碱性溶液中加热,DNA的磷酸二酯键就会在脱鸟嘌呤处断开。电泳之后在放射自显影图上显示出一组由G降解而产生的DNA片段。为测定DNA中A的位置可用稀酸处理使之脱嘌呤,再用碱断开磷酸二酯键,电泳图谱上条带即为A和G。对于嘧啶,可以利用水合肼处理,然后用哌啶催化β消除反应,使磷酸基团掉下。这种处理对C和T没有选择性。但如果在肼解时存在2M NaCl,则抑制了肼同T的反应,这样产生的条带相当于C的位置。
  RNA的顺序分析 RNA的顺序分析方法可以分为两大类,即片段重叠法和直接阅读法。前者为经典方法,目前仍有人使用,后者为快速简便的新技术,问世仅几年已经使RNA顺序分析研究出现了崭新的局面。
  片段重叠法 分别用二种以上的具有不同碱基专一性的核糖核酸酶将RNA分子水解成大核苷酸片段,然后分别分离和鉴定各水解产物,测定它们的核苷酸顺序及其相对含量。二种不同专一性的酶得到的二组核苷酸片段是相互重叠的,因此使用更多专一性不同的酶水解 RNA分子,解析结构的能力就更强。设某 RNA片段的顺序是ABCDCAD。可以使用二种专一性不同的水解酶,一种水解A和B,另一种水解D2结果如下:
  水解A和B:A↓B↓CDCA↓D=A+B+CDCA+D
  水解D:ABCD↓CAD=ABCD+CAD
这个片段的顺序可以推断为ABCDCAD。因为第1个酶解产物有CDCA顺序,即该顺序在原片段中是存在的。第2个酶水解得到ABCD和CAD二个片段,其可能的排列是ABCDCAD和CADABCD。但前者是唯一正确的,因为其中有CDCA顺序的存在。
  直读法 原理与DNA顺序快速测定法的原理相似,区别只在于制备片段的方法不同。目前使用最多的制备片段的方法是:①利用专一性核糖核酸酶控制酶解的直读法。如RNase A水解C和U;RNase T水解G;RNaseU2在适当条件下水解A;RNase phyl水解A、U和G,而对C的水解速度特别慢。如果RNA分子的5′端被32P标记,那么用上述酶进行控制水解后,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离,可得到几组以5′端为放射性同位素标记的,3′端为某一特定碱基的片段。经放射自显影后即可阅读顺序。此法受RNA二级结构影响较大,也读不出修饰核苷酸。②化学直读法。一般先用RNA连接酶将 RNA3′端接上放射性化合物 32PCp。然后分别用硫酸二甲酯(修饰G)、焦碳酸二乙酯(主要修饰A)、肼(修饰U)、无水肼(在3M NaCl中主要修饰C)进行限制修饰,得到几组以3′端为32P标记,5′端为特定碱基的片段。经变性凝胶电泳分离后,即可阅读顺序。此法受RNA二级结构的影响小,但也不能阅读修饰碱基。③互补 DNA(cDNA)直读法。在四种脱氧核苷三磷酸存在下,反向转录酶以RNA为模板反转录成互补的cDNA,然后用DNA顺序测定法测定cDNA的顺序,再推导出原来的RNA顺序。这种方法在测定mRNA和病毒RNA的顺序中用得很多。由于cDNA同样可以被克隆,因此测定方便。④末端鉴定的直读法。在一定条件下,无离子水或甲酰胺可以使每一分子RNA只有一个磷酸二酯键被水解,此水解无专一性,于是得到一组3′端的片段和一组5′末端的片段。用32P对5′端加以标记后,在聚丙烯酰胺凝胶电泳上按链长分离,切下凝胶条带或转移至DEAE-纤维素薄板上,经水解,鉴定它们5′末端的核苷酸,即可读出RNA的核苷酸顺序。此法受RNA二级结构的影响小,也能鉴定某些修饰碱基。但操作步骤较多,而且用于5′端同位素标记的激酶必须要很纯,不含核糖核酸酶。

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更新时间 : 2009-01-13

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