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2018年1月19日 星期五

丁酉(鸡)年十二月初三

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吸收光谱(紫外光和可见光) - 正文 [回目录]

  光透过某一物质时,某些波长的光被该物质吸收,因此在连续光谱中有一段或几段波长的光减弱了或消失了,这种光谱称为吸收光谱。不同物质的吸收光谱不同,这取决于物质的分子、原子和原子团,因此可用吸收光谱来鉴别物质和推测样品的结构;同时吸收光谱的强弱和物质的浓度有关,这个性质可用来做定量分析。
  原理 入射光(I0)经过均匀而透明的溶液时,一部分光被溶质吸收(IA),一小部分被反射(IR),只有一部分可以透过(IT)。

I0IAIRIT

在化学分析中,常用一个“空白”溶液作为参考去校正反射的光,则IR可以忽略不计。
I0IAIT
此处 I0又可以看作为透过“空白”的光强度,因为“空白”是不吸收任何光的。所以IT/I0是透光率(T),常用%来表示;但在实际应用中,往往用光吸收 (A)来表示。

A=logI0IT

图a吸收光谱(紫外光和可见光)是以T来表示的吸收光谱,而图b是文献中常见的以A表示的吸收光谱,从这两个图谱可以了解到TA的关系。
  当某一物质吸收一定波长的光时,若此时A=1,即其透过光的强度为照射光的10%;若A=2,表示浓度大了一倍,其透过光的强度为照射光的1%。根据贝尔定律,AELCA为光吸收,E为吸收系数,L为吸收杯光径,C为浓度。在溶液浓度不很大的情况下,由光在溶液中被吸收的程度A,可以决定溶液的浓度C,这就是吸收光谱定量分析的原理。
  分光光度计的构造和性能 分光光度计通常包括光源,分光系统和受光器等几个主要部分:
  光源 一般340纳米以上采用钨灯作为灯源,340纳米以下采用氢灯或氘灯作为灯源。在安装时,灯丝的位置要调节到恰好对准入光狭缝,此时灵敏度最佳。
  分光系统 指把混合的灯源光分散成个别光波的装置。一般是特殊玻璃或石英制的棱镜;另一种色散系统是衍射光栅。
  受光器 通常是光电池或光电倍增管。透过光的能量一般是很小的,受光器能把它转变成电流并放大,光电流的讯号和强弱再用电流计或记录仪显示或记录下来。光狭缝有两种表示方法,一种以毫米表示实际狭缝宽度,另一种用光谱狭缝表示,单位是纳米。狭缝愈小,光纯度愈高,但透过的光强度也愈弱,在实际应用中要根据实验的要求加以调整。存放样品的吸收杯,在测可见光时可采用玻璃制的吸收杯,在测紫外部分时必须采用石英吸收杯。
  常用的分光光度计是直接读数或零点法,也有用记录仪记录的。
  应用 任何物质只要它有吸收光谱,就可以用来做定性和定量分析。
  定性分析 根据样品吸收曲线的形状,并与已知物质吸收光谱对比,可知其是否同一物质。譬如生物样品中,蛋白质吸收高峰一般在280纳米,核酸通常吸收高峰在260纳米。氧化型辅酶Ⅰ吸收高峰在260纳米,而还原型辅酶Ⅰ在 340纳米出现一个新吸收峰。几种不同的核苷酸,它们的250纳米/260纳米和280纳米/260纳米比值是各不相同的,可以方便地区别开。
  定量分析 ①单组份定量,根据测量到的样品的光吸收值和已知的样品消光系数,可以计算出样品的量。②多组份分析,如果样品是个混合物,其中含有两种或两种以上的吸收物质,这些物质之间不起化学反应,其吸收光谱虽然互相重叠,但各自的吸收峰和峰谷是不同的,这样可以不经分离而直接用光谱法对各个组分进行定量测定。以两个组分A和B的混合物为例,选择二个波长,一个是A组分的最大吸收(憶),另一个是B组分的最大吸收(憻),再分别以A和B溶液在这二个波长下测出各自的消光系数(EAEBEAEb),然后再用混合物在这二波长下测出光吸收A憶和A憻。因此

A憶=EA·CA+EB·CCB

A憻=EA·CA+EB·CB
这两个式中除CACB是未知浓度外,其余光吸收(A)和消光系数(E)均为已测知数,解这联立方程,即可计算出浓度CACB。③酶活性测定,当酶反应的底物或产物中有一个明显的吸收光谱时,借测这个生色基团的出现或消失速度可以跟踪酶的反应。例如氧化型和还原型辅酶Ⅰ的互变在 340纳米处有一个吸收峰的消失或生成,这一特性经常用于测定某些脱氢酶的活性。
  差光谱法 差示分光光度法是测二种吸收光谱之差。其优点是能检出光吸收大的系统中比较小的光吸收变化。①当被测定物质浓度很大,而又不能稀释后再测定,如此测定的误差就会很大。有些高级的分光光度计虽然光吸收可以测到很高值,但也不能无限制的扩大。这种情况下可采用略低于样品浓度的已知浓度纯物质作为参考样品置于空白对照光径中,再进行未知样品浓度的测定,使得欲测定样品的读数仍然落在刻度盘读数范围内。②在研究蛋白质构象中,蛋白质或酶在加入作用物后,光谱会产生微小的变化,而蛋白质本身浓度往往较大,不容易察觉到这种微小变化。此时可在参考光径中把酶和作用物分别置于二个吸收杯中,而在测量光径中把酶和作用物放在同一个吸收杯中,而测量光径中的第二个吸收杯中仅为相应的缓冲液,这样进行波长扫描,可以清楚地观察到某些波长处的变化,并可定量。
  光谱滴定 滴定法中会有 3个组分──滴定剂、被滴定物和生成物。只要这三个组分中任何一个组分有光吸收,且在滴定过程中光吸收会增强或减弱,则可利用光谱法测得其滴定终点,计算其浓度。例如滴定蛋白质中某个氨基酸残基数,可用相应的试剂,每次加入一定体积后搅拌均匀并测其光吸收。尽管每次加入试剂体积极微,但仍需进行体积校正得到校正后的光吸收值。以光吸收为纵坐标,滴定剂量为横坐标,可以得到一个光谱滴定曲线,其转折点即为滴定终点。以蛋白质量与作用试剂的化学计量之比即可计算出此氨基酸残基数。
  在进行光谱分析时,除了仪器本身的性能,以及使用不妥会影响到测定结果外,还有一些因素也会影响实验结果。例如同一样品在不同溶剂中,它的吸收峰和消光系数往往不同;在不同PH下,光谱特性和光吸收也会有所变化。某些特殊情况下(例如酶反应),温度也会影响到测定,都需加以注意。

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更新时间 : 2009-02-15

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