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2018年1月18日 星期四

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生物大分子的散射技术 - 正文 [回目录]

  当可见光、电子束、X射线及中子辐射在含有生物大分子的非均一介质中传播时,能使这些大分子产生散射辐射。通过测量这些散射辐射的强度或频率,可以推算生物大分子的分子量、大小、体积、形状、结构及运动等性质。这种测量技术称为生物大分子的散射技术。由于入射线的种类不同,它们与生物大分子相互作用的性质不同,这项技术又可分为弹性光散射、动态光散射、喇曼(Raman)散射以及X射线和中子的小角散射技术等。它们主要用于测量生物大分子的溶液样品。其中喇曼散射和中子散射可以用来测量任何状态的样品,包括晶体、溶液及活细胞的组分等。
  弹性光散射 散射光与入射光波长相同的散射,也称为瑞利(Rayleigh)散射。度量散射光与入射光的相对强度的物理量称为瑞利比(生物大分子的散射技术),它与散射角(θ)有关。按照溶液中分子大小程度不同,这种散射又可分为两种情况:①当分子大小的量级(线度)比入射光的波长小很多时,它们在溶液中都是独立的散射子。此时散射光的相对强度与分子量(M)成正比关系:生物大分子的散射技术,其中C为样品浓度,K为比例常数。因此可由测定样品不同浓度的瑞利比,采用外推作图法求得分子量。②当溶液中分子的线度与入射光的波长量级相同时,需要考虑分子的几何形状以及分子内各部分散射光之间的相干效应。为此引入表示分子大小的物理量,称为回转半径(Rg)。它的定义是分子中各原子对于分子重心距离的均方根值。此时散射光的相对强度是样品浓度和散射角的函数。采用齐姆(Zimm)作图法可以求得大分子的分子量和回转

生物大分子的散射技术
半径。图示腹水肿瘤细胞tRNA分子光散射的齐姆图。图中对应C=0,θ=0两条外推曲线的交点即为纵坐标的截距1/M,相当于独立分子散射的情况。从C=0外推曲线的斜率可以求得回转半径。
  动态光散射 溶液中生物大分子准弹性散射的一种类型。由于生物大分子在溶液中实际上不断地作扩散运动,或存在如构象变化,聚合或解离等动态行为,使得散射光的频率和相位随时间变化。这种频移属于多普勒效应的性质,可由散射频谱分析法或延迟讯号的自相关分析法测定。这种技术可用来测定大分子在溶液中的扩散系数。它与分子的大小、形状有关,从而可以推算大分子的半径。如球状分子的扩散系数DKT/6πηa,其中K为玻尔兹曼常数,T为温度,η为粘度,a为分子的有效半径。
  喇曼散射 生物大分子的非弹性散射类型。当样品受到激光照射时,绝大部分散射光的频率与入射光相同。这就是上述的弹性散射部分。但在散射光谱中,在入射光的频率附近还存在许多强度很弱的谱线。它们构成喇曼振动光谱。这是因为入射光的电场迫使大分子中的电子、原子核及带电基团位移。这种位移的能力称为大分子的极化率 α,它随分子的转动和振动作周期性的变化。α变化的频率决定喇曼谱线的频移,变化的大小决定谱线的强度。另一情况是当入射线的频率接近或等于大分子中某个发色基团吸收带的频率时,振动跃迁与电子跃迁同时发生。这时大分子发出的散射光称为共振喇曼散射。它的强度比一般的喇曼散射强得多。
  生物大分子的喇曼光谱即它的振动光谱。生物大分子中的易极化基团如碳-碳双键(-C=C-)及二硫键(-S-S-) 等具有很强的喇曼谱线;球状蛋白质的α-螺旋β-折叠层可以从喇曼谱线中识别;生物大分子的骨架构型也有特征的谱线形式;甚至组分复杂的噬菌体也能给出分辨清楚的喇曼谱线。因此喇曼光谱可以用来研究生物大分子的结构。另外,振动光谱对大分子构象变化的响应极其灵敏,也可由喇曼谱线的变化研究生物大分子构象的变化。例如DNA、RNA分子的特征谱线增强,表示它们已经变性,当大分子从晶态变成溶液时,表示构象的自由度增加,而且存在与溶剂的相互作用。
  X射线及中子小角散射 小角散射的原理与大颗粒的光弹性散射相同。区别在于这个技术采用波长为 1埃左右的 X射线或中子辐射作为光源。因为生物大分子的线度比入射线的波长大得多,大部分的散射线限于接近入射线的方向,即散射分布的角度范围很小,所以这种技术称为“小角散射”或“低角散射”,有时简称“溶液散射”。它与光散射时一样,当外推到零散射角时,X射线或中子的散射强度与溶液浓度及分子量成正比关系,从而可以推算大分子的分子量和回转半径。相应的作图法称为吉尼尔作图法。
  在X射线及中子小角散射中,作为背景的溶剂散射不能忽略。这种散射甚至可能淹没溶液中大分子的散射。这种现象称为溶剂的反差效应。选用不同溶剂可以调节反差效果。在X射线散射中常用蔗糖与盐作为溶剂,但调节范围不大。在中子散射中常用水与重水 (D2O)作为溶剂。由于氢与氘 (D或2H)原子对于中子的散射能力差别很大(见生物大分子衍射技术),因此调节范围也宽。另外,对于一种生物大分子,可以采用D-H交换的办法改变它对中子的散射能力。由于各种生物大分子对于中子的散射能力也各不相同,因此对于一个多组分的生物大分子的复合体颗粒,可以采用改变溶剂的比例(H2O/D2O)并结合氘氢交换的办法,使得某些组分反差加强,另外一些反差减弱,从而可以确定这些组分的区域分布。应用这个技术已经测定了一些病毒、脂蛋白、核蛋白体、核小体以及一些与染色质有关的结构。

  参考书目
 G.Ehrenstein,H.Lecar,Methods of ExperimentalPhysics,Vol.20,Biophysics,Academic Press,New York,1982.

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更新时间 : 2009-05-12

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